摘要：

本文主要综述了光解水、光发酵、暗发酵、暗-光发酵耦合等生物制氢技术，分析各方法的产氢机制、工艺优劣、影响因素和研究现状等，同时对比了生物制氢反应器的类型与特点。结果表明：生物制氢在低品位能源处理与高级能源生产方面具有巨大潜力。最后，给出了目前生物制氢技术的发展建议。

氢气具有单位热值高、原料来源广、便于储存、易输送等优点，被国际公认为最有效的燃料之一，世界各国都在大力推动氢能的部署[1,2]。氢能不仅能够广泛替代化石能源，还可以根据氢燃料电池技术改善能源使用结构，实现城市热能与电力的联合供应，极大程度地促进经济发展和环境保护[3]。

氢气制备工艺主要有电解水制氢、化石能源制氢、化工原料制氢、生物制氢等[4,5]。电解水制氢技术具有工艺简单、对环境污染小、制氢纯度高等优点，但是电解水需要消耗大量电能，并且需要使用昂贵的催化剂，难以保证经济性[6]。从目前的产氢份额来看，化石能源制氢量仍占工业制氢总量的50%左右，欧美国家以天然气制氢为主，我国以煤气化制氢为主，但是该方法是以牺牲化石能源为代价且产氢效率不足60%,亟待技术进步[7]。甲醇等化工原料在一定温度、压力和催化剂条件下可以发生裂解反应制氢，该方法工艺简单、运行稳定、高效环保，但是制氢成本受工业原料甲醇的影响较大，并且制氢过程依赖催化剂，因此需要削减催化剂成本、提高催化稳定性[8,9]。

生物制氢主要是将贮存于自然界中的光能和有机物等，通过微生物生理代谢转化为氢气。根据微生物种类与代谢机制不同，生物制氢主要分为光解水制氢、光发酵制氢、暗发酵制氢3种。相比于其他制氢方法，生物制氢的优势有：(1) 反应成本较低且反应条件不苛刻，可以在常温常压下进行；(2) 不消耗化石能源，污染物产出量少，可以重复使用生物体，是一种优良的可再生方式；(3) 底物来源丰富，通常需要光能和有机物，这些资源可以广泛取自于太阳能、食品加工废水、工业有机废水、农业废料等，提高了能源的利用率[10,11]。

作为最有潜力的制氢方法，生物制氢技术具有很大的发展空间。目前，世界各国都在进行氢能方面的研究。通过大量调研，笔者对生物制氢方法进行总结，并且分析各方法的产氢机制与研究现状。

1、生物制氢方法

1.1 光解水制氢

微生物绿藻、蓝细菌等可以通过光解水产氢，其作用机理如图1所示。该方法类似于植物的光合作用，可以直接利用一次能源、水和CO2。以绿藻为例，其类囊体膜上具有2个光合系统(PSⅠ、PSⅡ),PSⅠ的主要作用是产生还原剂以还原CO2,PSⅡ的主要作用是光解水产生氢质子、自由电子和氧气。氧气进入线粒体进行呼吸作用以提供代谢能量；自由电子经质体醌、色素等传递至PSⅠ,在光照条件下实现能级跃迁，经铁氧还蛋白(Fd)最终传递给Fe-Fe氢酶，在氢酶的作用下氢质子与自由电子结合生成氢气[12,13]。

具有产氢优势的绿藻主要集中在团藻目和绿球藻目，包括莱菌衣藻、小球藻、夜配衣藻、斜生栅藻、绿球藻和亚心形扁藻等。其中，绿藻中的衣藻类的水解酶活性高、培养成本低，具有较大的产氢优势[12,14]。

光解水过程产生的氧气对氢酶具有极强的抑制效果，当氧气分压达到2%时氢酶失活，从而影响光解水产氢效率。同时，外源营养物质(如硫酸盐、醋酸盐等)也是影响绿藻产氢的重要因素。如何提高氢气与氧气的兼容性、增强氢酶对氧气的耐受性仍需深入研究[15]。Bechara等[16]利用硫剥夺法对提高微藻产氢能力的生物光溶循环过程进行优化，通过控制循环过程的反应时间、硫酸盐浓度、培养基pH来优化产氢能效，最终总产氢时间缩短11%,产氢率提高17%。可见正确设计反应工艺对提高藻类产氢效率的重要性，研究结果为优化微藻产氢提供新方向。Li等[17]对基质还原性程度与藻类发酵产氢性能的关系进行研究，分别使用葡萄糖和甘露醇作为底物观察褐藻的产氢效果，结果表明：每mol甘露醇的产氢量达到2.12 mol, 比相同条件下葡萄糖发酵的产氢量高出26.95 %;还原性较高的底物有助于提高产氢性能；褐藻在发酵产氢方面具有巨大潜力。

1.2 光发酵制氢

光合细菌(主要为专性或兼性厌氧菌)可以利用光能和有机物通过光发酵产生氢气，其原理如图2所示。光能经光捕获复合体吸收后迅速传递至光和反应中心并产生高能电子e*,高能电子再传递至PSⅠ进行环式磷酸化，生成三磷酸腺苷(ATP)。由于光合细菌无法裂解水，所以由底物提供光发酵过程所需的自由电子和氢质子。电子、氢质子经铁氧还蛋白传送至固氮酶，并且与光合磷酸化产生的ATP结合产氢。光合细菌发酵的用能来自光合磷酸化过程，因此光发酵的理论产氢效率高于暗发酵。光发酵的优势有：(1) 与藻类光解水机制不同，光合细菌只有PSⅠ,不含PSⅡ,其产氢过程不会产生氧气，因此不会出现氧气抑制氢酶的情况，终端产物纯度更高；(2) 光合细菌分布广泛，并且其吸收光谱的范围比藻类光解水吸收光谱的范围更广，光能转化率更高；(3) 光合细菌可以利用小分子有机酸或醇等物质进行反应，有机废水(如乳制品废水、淀粉废水等)富含大量挥发性脂肪酸，是光合细菌发酵产氢的理想底物[18,19]。

光合细菌主要包括4个科：红螺菌科、着色菌科、绿硫细菌科和绿弯菌科。其中，红假单胞菌、荚膜红细菌、类球红细菌、沼泽红假单胞菌等都具有良好的产氢性能[20]。

虽然光发酵技术相对成熟，但是仍存在诸多问题，如：(1) 光合制氢只对特定波长的光具有吸收作用，高效制氢的前提是保证合适的光线波长并满足光照强度和光照连续性等要求，这增加了光源的维护与管理工作；(2) 光合细菌生长过程中产生大量色素，使反应溶液浑浊度增加，光能传质效果衰减，难以保证光能利用率，并且光反应器放大设计较为困难，使经济性较差。Lu等[21]利用光合细菌HAU-M1对苹果废料进行光发酵制氢研究，结果表明：每 g底物的产氢量约为111.85 mL,苹果废料是光发酵制氢的良好底物。García-Sánchez等[22]利用假性红假单胞菌DSM 123对龙舌兰酒糟(VT)进行光发酵制氢研究，结果表明：相比于合成培养基，VT培养基的产氢能力高出1倍。该研究证明了VT光发酵制氢的良好性能，并且为进一步研究VT发酵制氢提供理论基础。

1.3 暗发酵制氢

1.3.1 暗发酵制氢简述

部分异养厌氧型细菌可以利用有机物进行产酸产氢，其优势有：(1) 无需光源，相比于光发酵制氢，暗发酵过程无需光能，节约了光源的维稳成本，并且使反应器的设计与操作更容易应用到工业规模；(2) 原料来源丰富，作为异养细菌，暗发酵底物来源丰富且容易获得，工业有机废水、农业废料等均是暗发酵的良好原料；(3) 产氢效果好，暗发酵细菌在培养过程中的生长速度普遍快于光合细菌，并且由于条件更可控，实际产氢效果较光合细菌更好[13,23]。

厌氧发酵产氢的微生物主要包括梭菌属、脱硫弧菌属、丁酸杆菌属、埃希氏菌属、醋微菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属等。暗发酵制氢细菌种类丰富，具有较高的底物转化率和能量利用率[13,24]。

随着研究的深入，学者通过多种方法(如细胞固定化技术)实现纯菌种高效持续产氢。相比于纯菌培养，混合菌种培养的优势有：(1) 制氢过程不存在杂菌污染，并且基底易聚集，沉降性较好，有效防止反应过程中生物量的流失；(2) 底物利用范围更加广泛，生活生产废水、农业废料等经过一定预处理即可作为反应原料；(3) 易规模化且管理方便[25]。但是，混菌培养基中除了存在产氢菌，还存在其他具有负面影响的菌种，如耗氢细菌、产甲烷菌，因此需要进行预处理。对于活性污泥，可以通过对活性基底进行物理化学预处理(如热预处理、酸碱预处理等)、曝气预处理和投加产甲烷菌特性抑制剂预处理，使有害菌种灭活[26,27]。

1.3.2 暗发酵细菌产氢机制

暗发酵细菌不具备完整的呼吸链电子转移体系，在厌氧条件下，细菌将脱氢作用产生的过量电子经发酵途径转化为氢气，从而获得充沛的生长代谢能量且维持代谢过程的氧化还原平衡。细菌厌氧发酵产氢机制主要有糖酵解(EMP)途径丙酮酸脱羧产氢和辅酶Ⅰ(NADH/NAD+)氧化还原平衡产氢2类。

(1) EMP途径丙酮酸脱羧产氢机制

厌氧发酵产氢菌有2种方式直接产氢，并且均发生在丙酮酸脱羧过程[28,29]。丙酮酸脱羧产氢过程常见于梭菌属，碳水化合物经糖酵解途径产生的丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下脱羧，形成硫胺素焦磷酸-酶的复合物与乙酰辅酶A(CoA),同时将电子转移给铁氧还蛋白，还原型铁氧还蛋白被铁氧还蛋白氢化酶氧化，实现电子与氢质子的结合，生成氢气。肠道杆菌型产氢途径通常为丙酮酸在丙酮酸甲酸裂解酶的催化下分解成乙酰辅酶和甲酸，甲酸在铁氧还蛋白参与和氢化酶作用下生成氢气、CO2。

(2) NADH/NAD+平衡产氢机制

细菌正常代谢的前提之一是保持辅酶Ⅰ的氧化还原平衡。葡萄糖可以通过糖酵解途径生成还原型辅酶Ⅰ,并与丁酸、丙酸、乙醇发酵过程进行耦联，被氧化为氧化型辅酶Ⅰ。但是，辅酶Ⅰ的氧化与还原速率不相等，NADH的积累会影响细胞正常生理代谢。部分细菌可以通过NAD+/NADH平衡调节机制将氢质子转化为氢分子且释放到细胞外以维持生物体代谢稳定[29,30]。

1.3.3 暗发酵制氢类型

根据发酵液末端产物不同，暗发酵主要分为丁酸发酵、丙酸发酵和乙醇发酵。研究表明，当底物为葡萄糖、淀粉、蔗糖时，部分细菌的发酵末端产物主要为丁酸、乙酸、氢气、CO2,呈现丁酸型发酵。丁酸发酵的优势菌种主要为梭菌属，其中，丁酸梭状芽胞杆菌和酪丁酸梭状芽胞杆菌具有良好的产氢性能[31,32]。在厌氧条件下，当发酵底物为乳酸、葡萄糖、甘油、含氮有机物或纤维素时，部分细菌的发酵末端产物为丙酸、乙酸和CO2,呈现丙酸型发酵。丙酸型发酵的优势菌种主要为丙酸杆菌属，如产酸丙酸杆菌、特氏丙酸杆菌等。由于产丙酸途径没有氢气生成，所以研究单纯的产丙酸制氢意义不大。但是，在混合菌种培养模式中，产丙酸菌会与其他类型产氢菌进行底物和生态位的竞争，改变微生物群落演替方向，从而使发酵系统的制氢能力显著下降。因此，严格控制发酵类型、引导菌群演替方向对生物制氢具有重要意义[31,32]。Ren等[33]从厌氧产氢污泥中分离出1种新型自聚集产氢细菌，其中部分细菌在以葡萄糖为底物进行厌氧发酵时，其液相末端产物以乙醇和乙酸为主，呈现出乙醇型发酵特征，将此类细菌命名为产乙醇杆菌属，如哈尔滨产乙醇杆菌。乙醇发酵的优越性在于乙醇是中性产物，降低了氧化还原电位对细菌产氢的干扰作用，具有较高的代谢速率和产氢效率，逐渐成为生物制氢的研究热点。

虽然目前在微生物制氢机理研究与应用开发等方面都取得一定进展，但是仍存在诸多问题亟待解决。培育优良菌种、挑选优良底物、消除发酵废液及相关副产物对环境影响等方面研究均是优化暗发酵技术的关键[34]。Zhao等[35]研究了多溴二苯醚(PBDEs)对污泥暗发酵制氢的影响，结果表明：相比于空白对照组，在添加12.0 mg/kg的PBDEs时，产氢率下降约30.1%。PBDEs能够诱导活性氧的产生，可以直接导致细胞失活并抑制产氢相关酶的活性。该研究表明，PBDEs对暗发酵微生物具有毒害作用，严重影响群落的多样性与制氢效率，因此进行相关研究前需要做好预处理。Chantawan等[36]利用木薯浆(CP)和木薯加工废水(CPW)进行暗发酵制氢，CP漂浮在CPW上面，利用其水解物进行发酵产氢。结果表明：每g还原糖的产氢量约为225.2 mL,达到最大化学计量值的83.1%。该研究证明了木薯加工废料在暗发酵制氢中的适用性，拓展了工农业废料在暗发酵制氢过程的应用。Islam等[37]研究了预处理对两步暗发酵工艺产氢的影响，在不同温度和不同硫酸含量下对第一阶段完成水解后的木质纤维素底物进行预处理。结果表明：在120 ℃、底物密度为10 g/L、处理酸含量为1.5%(质量/体积)条件下获得最大产氢率，此时每g底物的产氢量约为5.77 mmol。该研究表明，使用两步暗发酵工艺可以显著提高暗发酵制氢效率，同时预处理在暗发酵制氢过程中也起到重要作用。

1.4 暗-光发酵耦合制氢

暗发酵与光发酵在发酵条件、底物类型等方面存在差异，二者具有极强的互补性和协同发酵的潜力，因此可以将二者耦合制氢。暗-光发酵耦合制氢技术主要包括暗-光发酵细菌混合培养制氢和两步法发酵制氢。

1.4.1 暗-光发酵细菌混合培养制氢

厌氧发酵过程会消耗大分子有机物并产生小分子有机酸以维持微生物生长代谢。但是，发酵末端有机酸(如丁酸、乙酸等)会随着发酵时间的增加而不断累积，导致发酵系统pH呈现过酸性，使暗发酵细菌失活。这是纯暗发酵培养难以工业规模化的主要原因。光合细菌可以通过小分子有机酸或醇来完成自身的增值代谢。当厌氧发酵细菌与光合细菌共存于同一系统时，光合细菌可以分解暗发酵过程累积的有机酸，从而减少有机酸对暗发酵制氢过程的抑制。将暗发酵与光发酵细菌混合培养可以使不同类型的产氢菌各取所需，同时强化对不同类型底物的转化率且扩大适用底物范围，从而提高整个制氢体系的效率[38]。对混合培养发酵产氢的部分研究如表1所示。

虽然暗-光细菌混合培养发酵具有较高的理论产氢率和底物转化率，但是混合发酵也存在诸多问题：(1) 厌氧发酵细菌适宜pH为酸性的生态环境，而光合细菌的适宜pH为中性，暗发酵代谢产物的累积使系统pH呈明显的酸性，严重抑制光合细菌的正常生长代谢，使产氢效率大幅降低；(2) 虽然产氢能力有所提高，但是目前联合培养菌种的数目较少且底物成分复杂，难以做到菌种协调生长和充分利用底物[41]。针对混合培养存在的问题，最优解决方法是研发强耐受性的高效产氢菌株，以增强菌种对环境pH变化的耐受性和联合产氢的协调性。混合培养产氢工艺和机制相对复杂，存在较多技术障碍，该工艺仍有较大发展空间[42]。

Li等[43]研究嗜热糖解梭菌和热纤梭菌混合培养发酵产氢，结果表明：在125 mL厌氧瓶混合培养发酵过程中，每g玉米茎水解物的产氢量约为68.2 mL,比单培养发酵过程高94.1%;在8 L连续搅拌的反应器中，每g玉米茎水解物的产氢量约为74.9 mL。可见通过混合培养模式利用木质纤维产氢是可行的。Zagrodnik等[44]以淀粉为底物，利用丙酮丁醇梭菌与球形红杆菌进行混合培养产氢研究，结果表明：在淀粉的有机负荷率(OLR)为1.5 g/(L·d) 条件下，混合培养11 d的产氢累积量约为纯暗发酵过程的2倍，平均每mol己糖的产氢量为1.99 mol, 约为纯暗发酵过程的3倍；混合培养模式下淀粉分解的产氢量远高于单培养模式，研究结果为进一步强化连续条件下淀粉转化为氢提供参考。Policastro等[45]以酿酒废水为底物，利用肺炎克雷伯氏菌和红假单胞菌进行混合培养产氢研究，结果表明：相比于单培养模式，混合培养模式提升了细菌分解复杂底物的协同性，增强了有机物向氢气转化的效果。

1.4.2 两步法发酵制氢

由于发酵细菌混合培养产氢存在一定弊端，Nath等[46]利用两步法联合制氢，显著提高了葡萄糖的产氢量。将暗发酵产酸过程与光发酵分解有机酸过程进行分离，从而消除2类细菌因生长pH不同而引起的代谢不协调等问题。相比于混合培养，采用两步法发酵制氢使不同类型细菌的相互影响较小，产氢效率更高。对两步法发酵产氢的部分研究如表2所示。

虽然两步法制氢工艺具有诸多优势，但是也存在一些技术问题阻碍其工业化发展。两步法制氢工艺需要分别为暗、光发酵过程定制反应器，这使其工艺更加复杂、处理步骤更加繁琐。同时，暗、光发酵的2类细菌无论是生长速率还是产氢率都具有明显差异，难以做好协调产氢，这是限制其规模化生产的关键因素之一[50]。

Zong等[51]采用连续暗、光发酵两步法对木薯和食品废料制氢进行研究，结果表明：每g木薯水解物的产氢量为810 mL,每g食品废料的产氢量为671 mL,产氢量约为纯暗发酵过程的2～4倍；同时，木薯批次与食品废料批次化学需氧量(COD)去除率分别达84.3%、80.2%。Yang等[52]采用连续暗、光发酵工艺研究玉米芯生物制氢，结果表明：暗发酵过程，每g玉米芯水解物最多产生约120.3 mL氢气；光合细菌进一步分解暗发酵的流出液，每g暗发酵流出液COD产生约713.6 mL氢气；同时，COD去除率达到了90%。研究表明玉米芯暗发酵流出液是光合细菌制氢的良好底物，采用两步法发酵玉米芯产氢具有可行性和高效性。Zhang等[53]采用两步法发酵对玉米秸秆水解物在11 m3暗-光反应器中的产氢过程进行研究，结果表明：当暗发酵过程的pH为4.5、温度为35 ℃,光发酵过程的pH为7.0、温度为30 ℃时，产氢速率约为(59.70±2.58)m3/d; 暗发酵单元单位体积反应器的产氢速率为7.5 m3/d; 光发酵单元单位体积反应器的产氢速率为4.7 m3/d。研究表明两步法发酵制氢可以强化生物质的产氢能力，但是不同单元的氢气产量差距较大。Adessi等[54]利用嗜淀粉乳酸杆菌与红假单胞菌，采用两步法发酵，对烘焙食品废料产氢过程进行研究，结果表明：以处理后的烘焙食品废料为底物时，每mol葡萄糖产生3.1 mol氢气，产氢量处于较高水平。该研究表明，相比于单发酵过程，两步法制氢工艺可以提高烘焙食品废料的产氢率，为含能食品垃圾的再利用和循环经济的改善提供参考。

1.5 不同生物制氢方法对比

生物制氢方法具有良好的产氢性能，不同制氢方法的产氢原理和适用范围存在差异。表3对各类生物制氢方法进行了对比，说明了各类生物制氢方法的优缺点。

2、生物制氢影响因素

2.1 底物类型

在厌氧光照条件下，光合细菌可以分解多种有机酸进行代谢产氢，如乙酸、丁酸、乳酸、苹果酸等。同时，光合细菌还可以利用单糖(如葡萄糖、果糖)和多糖(如淀粉)进行制氢。工业废水和农业废料水解物富含各种有机酸、碳水化合物，均是光发酵制氢的良好底物[40,55]。Keskin等[56]利用制糖工业废水进行光发酵制氢研究，结果表明：以甜菜制糖废水为底物具有较高产氢量，即每mol蔗糖产生10.5 mol氢气，达到纯蔗糖培养基产氢率的75%。该研究表明制糖废水具有良好的制氢潜能，在光发酵过程中，含能废料的再利用可以替代高纯度有机培养基。Jiang等[57]利用玉米茎进行光发酵制氢研究，结果表明：以玉米茎水解物为底物时，每mol碳水化合物产生约2.6 mol氢气，底物转化率高达94%,高于葡萄糖光发酵制氢的底物转化率(80%)。该研究证实利用玉米茎进行光发酵制氢具有良好能效，为含能农业废料再利用提供参考。

厌氧发酵细菌可以利用多种碳水化合物(如葡萄糖、半乳糖、淀粉、纤维素)进行发酵，也可以利用蛋白质和脂肪类，但是在相同条件下，厌氧发酵细菌利用碳水类的产氢能力通常大于脂肪类和蛋白质类。厌氧发酵细菌的分解范围较广，食品工业废水、农业废料、餐厨垃圾等均可以作为暗发酵制氢的常用底物[39,58]。Namdarimonfared等[59]利用造纸厂废水进行暗发酵连续制氢研究，结果表明：每g造纸厂废水COD的最大产氢量约为0.96 mmol且氢气纯度高达41.5%,以造纸厂废水为底物进行暗发酵具有良好的产氢性能，为工业废水处理提供了新途径。Mikheeva等[60]对糖果废水在厌氧流化床反应器中连续发酵制氢进行研究，结果表明：以糖果废水为底物进行发酵时，每g底物COD的最大产氢量约为44.73 mL且氢气纯度可达36%,说明利用糖果等食品废水充当发酵底物是可行的。

2.2 温度

温度在维持细菌活性和高效产氢方面至关重要。对于光合细菌，在一定温度范围内，其代谢产氢效果通常随温度的升高而增强，直至达到最佳细胞生长速率和产氢率。当超温时，细胞活性和产氢能力大幅降低。相关研究表明，光发酵制氢的最佳温度一般为28～32 ℃。虽然存在微生物可以在超过35 ℃环境下生长代谢，但是极少嗜热微生物应用于光发酵制氢[61]。

对于厌氧发酵细菌，根据最适反应温度区间可以大致归类为嗜冷菌(0～25 ℃)、嗜温菌(>25～45 ℃)、嗜热菌(>45～65 ℃)、极端嗜热菌(>65～80 ℃)和超嗜热菌(>80 ℃)。发酵过程中各种生化反应的顺利进行和特定酶维持高活性都需要最佳温度的支持[62,63]。Toledo-Cervantes等[64]研究了龙舌兰酒在中温和嗜热条件下的发酵产氢情况，结果表明：在pH为5时，35 ℃和55 ℃时的最大产氢速率分别为(25.5±0.01) mL/h 和(169.9±8.9) mL/h; 在厌氧批序式反应器运行过程中，嗜热条件下的产氢率远高于中温条件。Xiao等[65]利用阴沟埃希菌和产气肠杆菌对食品废料进行厌氧消化产氢研究，结果表明：以处理后的食品废料为底物时，温度为37 ℃左右时的产氢效果最佳(每g底物产生约155.2 mL氢气),远高于温度为21.5 ℃时的产氢量，因此温度的选择对产氢效果至关重要。

2.3 pH

对于光发酵制氢，pH可以改变细胞膜的带电性和胞内固氮酶的活性，影响细菌生长代谢活性和产氢能力。同时，pH可以影响暗发酵氢化酶的活性和底物营养物质的供给。一方面，较低的pH会抑制生物产氢途径，甚至使菌体失活；另一方面，虽然高pH环境下产氢的滞后时间较短，但是最大产氢量会随pH的增加而降低[66,67]。通常情况下，暗发酵制氢的最适pH为5.5～6.5,而光发酵制氢的适宜pH为6.8～7.5。不同种属细菌适宜的pH不尽相同，环境的改变对其产氢能力也有显著影响[38,68]。Praptyana等[69]研究了不同pH下产气肠杆菌对红木发酵产氢效果的影响，结果表明：在臭氧预处理15 min条件下，产氢能力随pH的升高而增强，当pH=11时，产氢量达到最大(每g红木水解物产生约57 mL氢气),分别高于pH=7和pH=3时约14%和15%。Ziara等[70]研究了初始pH(6.5、7.5、8.5)对乳酸废水暗发酵制氢的影响，结果表明：在45 ℃条件下，初始pH=7.5时，产氢量最高(每mol乳酸产生约0.85 mol氢气);当初始pH=6.5时，产氢能力骤降，产氢量仅有初始pH=7.5时的30%;当初始pH=8.5时，产氢能力也有一定下降。乳酸废水发酵制氢效果受pH影响显著，因此需要严格控制pH以获取最大产氢效果。

2.4 金属离子

光发酵过程中的固氮酶由金属位点组成，固氮酶直接与光合磷酸化过程的产物结合产氢。因此，固氮酶的活性直接影响光发酵制氢过程的产氢效果。相关研究表明，金属离子不仅能加强光合细菌胞内电子转移，还能促进固氮酶的合成。铁、镍、锌等金属作为光发酵制氢过程的添加剂都可以在一定程度上提高产氢率，加强底物利用率[71,72]。Lu等[73]研究了铁离子对玉米秸秆光发酵制氢性能的影响，结果表明：在添加2 500 μmol/L 的铁离子时，每g玉米秸秆的产氢量达到最大(70.25 mL),能量转化率为5.21%,比不添加铁离子时的产氢量提高19.98%,说明适宜浓度的铁离子可以促进光发酵制氢过程的产氢效果。

金属离子对暗发酵制氢过程氢酶的合成与能效也具有一定的调控作用。同时，金属离子可以作为生态因子直接参与细胞的增殖和代谢，增强电子传递，富集产氢细菌[74,75]。Hwang等[76]研究了零价铁(ZVI)对葡萄糖制氢效果的影响，结果表明：在不添加ZVI条件下，产氢率随底物浓度的增加而降低；在添加ZVI条件下，产氢效果有所增强，并且产氢率随底物浓度的增加而提高。Zhang等[77]研究了Fe2+和生物炭对葡萄糖制氢效果的影响，结果表明：与对照组相比，产氢效果随添加Fe2+含量的增加而增强，在添加Fe2+含量为200 mg/L时，产氢量达最大(每g葡萄糖产生约217 mL氢气),添加Fe2+工况的氢气累积量和产氢率均远高于对照组。研究表明添加适量Fe2+可以促进氢酶活性，提高产氢效果。

2.5 光照强度对光发酵制氢的影响

在光发酵制氢过程中，光为电子传递和代谢产氢提供必需的能量。对于光发酵制氢，在一定范围内，产氢效率随光照强度增强而提高。但是，光照强度过大或超过其阈值，会对制氢过程产生光抑制作用。光发酵高效制氢的光强度一般为6～6 000 Lux[78]。光合细菌在产氢过程中会生成大量色素和代谢产物，光扰动和震荡是减缓基质浑浊的有效方法[49,78]。Shui等[79]提出了一种光扰动策略来打破光发酵制氢系统的平衡以促进光合细菌的生长、提高产氢能力，结果表明：在6 000 Lux扰动条件下，产氢率和产氢速率分别比无扰动时增加19.5%和26.2%。研究表明补充光照产生光扰动是提高光发酵产氢率的有效途径。Zhang等[80]研究了震荡、照明对玉米芯光发酵制氢性能的影响，结果表明：在震荡条件为150 r/min、光照强度为6 000 Lux时达到最大产氢量(每g玉米芯水解物产生约48 mL氢气),最大光能转换率为11.04%,比静态条件时分别提高了603.85%和598.63%。研究表明震荡与光照强度的相互作用使玉米芯光发酵制氢性能显著提升。

2.6 水力停留时间对厌氧发酵制氢的影响

水力停留时间(HRT)指待处理物质在反应器内的平均停留时间。HRT的主要影响参数为反应速度、活性生物组成和活性生物量浓度。传统暗发酵制氢的HRT普遍为几个小时或1天，最佳制氢HRT通常为8～14 h。由于微生物生长增殖作用，产氢生物通常在短HRT内获得充足的代谢能量和物质。但是，过低的HRT则会使液相流速过大，导致细胞被大量冲刷，降低生物量。同时，HRT的改变会影响底物利用率和有机负荷等指标。因此，应根据不同类型制氢工艺与底物选择适宜HRT,从而实现最大产氢率[81,82,83]。Ottaviano等[84]研究了水力停留时间(8、6、4、2、1、0.5 h)对干酪乳清溶液连续嗜热产氢的影响，结果表明：产氢速率随HRT的降低而增加， HRT为0.5 h时的产氢速率最大；HRT为4 h时的产氢量最大(每mol乳糖产生约3.67 mol氢气)。可见HRT对发酵产氢具有显著影响。

2.7 有机负荷率对厌氧发酵制氢的影响

生物制氢有机负荷率(OLR)是指在单位时间、单位反应器体积内生物消化的有机物量。反应器中的OLR取决于多种因素，如pH、底物浓度和反应器类型等。有机废料中碳水化合物的转化与反应器中的OLR成反比，因此有机物浓度过高或过载会影响产氢性能。相关研究表明，最大产氢率对应的OLR大于最大产氢量所对应的OLR。因此，在选择最佳OLR时，应考虑高产氢率和总产氢量[85]。Kim等[86]研究了OLR为10、15、20、40 g/(L·d)时乳酸型发酵的产氢能力，结果表明：在HRT为24 h时，产氢能力随OLR增加而逐渐下降。Zhang等[87]研究了OLR(10、20、40、60 g/(L·d))和HRT对高盐度底物发酵产氢的影响，结果表明：在HRT为6 h的条件下，OLR为20 g/(L·d)时的产氢能力最强，即每mol葡萄糖产生约1.1 mol氢气；随着OLR增加，产氢能力下降；当OLR为60 g/(L·d)时，产氢能力仅为最大产氢能力的60%。因此，OLR在生物制氢实验和生产中极为重要，维持最佳OLR是高效制氢的前提。

2.8 其他

氧化还原电位(ORP)是产氢发酵过程细胞应激反应的主要触发参数之一，影响生化反应信号通路与氧化还原蛋白及酶的表达，如铁氧还蛋白、脱氢酶等。厌氧发酵多为专性厌氧菌，其产氢体系蛋白及酶往往在低ORP环境下才能高效产氢。研究表明，有效控制细胞外ORP可以促进发酵产氢菌代谢、提高产氢能力[88,89,90]。

细菌产氢是厌氧发酵过程，该过程需要在密闭无氧和低ORP条件下进行代谢。反应过程产生的氢气积累过多则会导致系统内氢气分压过大，从而抑制产氢过程、产生更多的副产物(如乙酸、丙酮等)。同时，发酵产物CO2也会对产氢过程产生明显抑制作用。目前，通常采用喷射惰性气体(如氮气、氩气)的方式来稀释反应器内氢气的浓度，或直接通过真空泵或膜系统及时移出氢气[91,92,93]。

3、生物反应器

根据生化过程的实现方式，生物制氢反应器可以分为序批式反应器和连续式反应器。序批式反应器主要应用于实验室初步探究发酵制氢最佳条件和工业优化等过程，具有设计简单、成本低、参数控制方便等优点。连续式反应器具有更高的预期工艺效率，适宜规模化，是工业高水平生产的首选方式。发酵制氢常用的生化设备有连续搅拌槽式反应器(CSTR)、膜生物反应器(MBR)、厌氧流化床反应器(AFBR)和升流式厌氧污泥床反应器(UASBR)[58,62]。

实验室常用反应器为CSTR,该类型反应器设计简单、易于操作、尺寸较小且反应器内部存在持续搅拌，可以均匀介质并使产生的氢气及时从反应混合物中剥离出去。但是，该类反应器的生物量受HRT影响显著，为了保持细菌增殖与冲出平衡，通常需要较长的HRT且必须小于所使用微生物的最大生长速率[94,95]。UASBR属于高效厌氧处理工艺，该类型反应器利用活性污泥良好的凝聚性与进水升流的结构特点，在反应区形成颗粒污泥床和悬浮的产氢颗粒，产氢颗粒具有高保留率、高毒抗性、传质效果好等优点。UASBR的适用基质类型广泛，同时可以适应较大幅度的OLR和较短的HRT,但形成产氢颗粒的时间较长[94,96]。AFBR采用流态化原理，该类型反应器可以使微生物附着在固体颗粒表面或生物膜上。在该反应器中，处于悬浮态的颗粒增加了微生物与底物的接触机会，同时反应器内流体会对颗粒产生扰动，使得相间速度差较大，促进了体系催化效果和底物降解程度。AFBR需要外加能源以维持系统流化状态，因此其能耗较高[97,98]。 MBR是一种将膜分离单元与生物处理单元相结合的反应器，该类型反应器可以利用膜将微生物保留至反应器内，免除了洗脱生物质的负面影响，可以更好地控制反应参数。但是，MBR存在膜被污染的问题且系统运行成本较高[99,100]。表4对比了4个生物反应器在发酵制氢方面的优势与局限性。

4、结论

(1) 需要培养新型高产菌株，改善产氢菌对外界环境的适应能力和抗毒害能力，提高其对底物的利用率和产氢稳定性。

(2) 产氢系统的温度、pH等条件对产氢菌影响很大。因此，需要根据反应条件选择最佳参数并精准控制，从而提升产氢稳定性和高效性。

(3) 生物制氢底物来源广泛，需要针对不同发酵制氢类型选择最适合的底物。同时，需要提高底物预处理水平，削减底物中的毒害物质对产氢菌的损伤，消除有害菌对产氢菌的竞争与抑制作用。

(4) 对反应器设计与布置工艺进行优化，针对不同发酵制氢类型选用最适合的反应器以增强各类发酵方式的制氢效果。同时，需要减少反应器在产氢工艺中的各类能耗，节约制氢成本。

(5) 深度研究暗-光发酵耦合制氢原理，培养同一生态位的光合细菌与厌氧发酵细菌，使二者可以协同共生，从而解除彼此抑制作用并提高产氢能力。同时，需要削减耦合制氢工艺的成本。